Dans sa jeunesse, Ondřej Holub a été membre du Chœur d’enfants Kühn et du Chœur de garçons Pueri Gaudentes. Il a étudié le chant classique en privé avec Lenka Pištecká, puis au Conservatoire de Prague auprès de Valentin Prolat. Il se perfectionne actuellement avec Jiří Kotouč. Depuis 2017, il collabore avec l’Ensemble Damian, dirigé par Tomáš Hanzlík, qui se consacre à la redécouverte des opéras baroques. Il a chanté dans les opéras La contesa de numi de Leonardo Vinci (dans le rôle de Marte) et L’amor non ha legge d’Antonio Caldara (en Tirsi). Ces deux opéras ont été présentés au Festival baroque d’Olomouc, et L’amor non ha legge a été joué à trois reprises au Festival Smetana de Litomyšl 2018, au château de Nové Hrady.
En tant que soliste, Ondřej Holub collabore avec de nombreux ensembles et orchestres : Orchestre philharmonique de Bohême-du-Sud, Orchestre philharmonique de Hradec Králové, Canticorum Iubilo, etc.. Il est actuellement membre d’ensembles tchèques de renom spécialisés dans la musique ancienne : Collegium 1704, Schola Gregoriana Pragensis, Cappella Mariana, Collegium Marianum, Ensemble Inégal, Musica Florea, Czech Baroque Ensemble et Ensemble Victoria. De 2013 à 2019, il a fait partie de l’ensemble vocal Martinů Voices, dont le répertoire comprend la musique du XXe siècle et la musique contemporaine. Il participe régulièrement à de prestigieux festivals tchèques et internationaux.
En 2007, il est devenu membre du quintette vocal masculin Rudolfvoice, fondé par d’anciens membres du Chœur de garçons Pueri Gaudentes, et s’est produit avec ce quintette au Kennedy Center de Washington. En outre, il collabore avec le Chœur philharmonique de Prague et a participé à la Deuxième Symphonie de Mahler au Carnegie Hall de New York, donnée à l’occasion du centenaire de la fondation de la Tchécoslovaquie.